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            非小細胞肺癌穿刺活檢標本基因檢測的標準流程
            編者按:晚期非小細胞肺癌大多采用穿刺活檢標本進行病理學診斷和基因檢測,由于活檢標本中腫瘤組織含量少,因此,采用最佳的檢測方法對患者的治療非常重要。本文針對非小細胞肺癌穿刺活檢標本進行基因檢測應該采用的標準流程進行了比較詳細的介紹,也闡述了不同樣本應采取的適應檢測方法。
              肺癌是目前世界范圍內死亡率最高的惡性腫瘤,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占其總數的85%。對于一些影像學高度懷疑癌的結節,在CT引導下通過不同方式取材活檢行病理學檢查,對肺內結節的明確診斷及后續治療起到了重要的作用,其準確性高,可操作性強。而在實際工作中,由于患者穿刺組織少,極易造成漏診和誤診,特別是經過常規制片HE染色,免疫組織化學檢查等鑒別診斷后,剩余組織較少,很難再進行進一步分子病理檢測,嚴重影響患者的治療。因此非小細胞肺癌穿刺活檢標本需要嚴格且規范的基因檢測流程。
              十年前,晚期NSCLC的治療相對統一,全身化療效果有限?,F如今,腫瘤基因組學和/或免疫生物標志物檢測在晚期NSCLC(尤其是腺癌)的初始評估和治療中必不可少。全球范圍內已獲批與治療相關的生物標志物列表包括:表皮生長因子受體(EGFR)基因突變、間變性淋巴瘤受體酪氨酸激酶(ALK)基因重排、ROS原癌基因1受體酪氨酸激酶(ROS1)基因重排、B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶(BRAF)V600E基因突變、程序性死亡配體1(PD-L1)的表達。此外,罕見基因的驅動位點近些年來有了新的突破,如:MET原癌基因受體酪氨酸激酶(MET)基因突變或擴增,HER2受體酪氨酸激酶2(ERBB2)基因突變和擴增、Ret原癌基因(Ret)基因重排和神經營養受體酪氨酸激酶(NTRK)基因重排等。然而,肺癌中最常見的基因組事件-腫瘤蛋白P53(TP53)和KRAS原癌基因GTPase(KRAS)基因突變仍是難以確定的藥物靶點。
              穿刺組織進行這些分子檢測時,首先樣本采集及處理是確保后續基因檢測的關鍵和基礎。樣本的先期處理更是所有后續檢測的根本保證,不同樣本如果采集處理不規范則會導致檢測結果不準確,易出現假陰性或者假陽性,對患者用藥造成很大影響。在樣本處理的中心環節,DNA提取之前的病理質量控制非常重要,它決定了最終檢測結果的可靠性。而RNA提取常比較困難,尤其是保存年限較長的腫瘤組織,RNA降解非常嚴重。因此從樣本的儲存、RNA的提取及保存,都需要格外小心,防范RNase對RNA的降解作用。同時,還要注意采集時防止污染,對檢測樣本造成不必要的干擾。以EGFR檢測為例,它不僅能夠預測小分子EGFR TKI的療效,是TKI療效重要的預測因子,標本污染或處理不當導致DNA過度降解可能導致EGFR檢測假陽性或假陰性,進而延誤患者的治療。組織活檢小標本的分子檢測平臺的選擇:常規分子病理診斷技術仍然是目前主流,NGS等高通量高敏感技術已走向前臺??蛇x擇的平臺有:1.免疫化學(IHC)檢測;2. 熒光原位雜交(FISH)檢測;3. ARMS-PCR檢測;4. 核酸序列測定:包括Sanger測序、焦磷酸測序和NGS測序。NGS是目前“熱門”的分子病理檢測技術,它可以邊合成、邊測序,多位點、多基因同時檢測。同時還可以對腫瘤進行用藥指導,既可以定性檢測也可以定量檢測。在小組織標本樣本量充足的情況下,可應按指南進行相應的分子檢測?,F階段單基因檢測地位不可取代,PD-L1 IHC檢測目前面臨諸多挑戰,國內缺乏檢測標準。EGRR、KRAS、BRAF和HER2等基因突變推薦單基因檢測和NGS全外顯子組測序;FGFR2和MET的基因擴增優先推薦FISH檢測;ALK,ROS1和RET的基因重排推薦FISH和RT-PCR檢測;EGFR、MET、PD-1/PD-L1蛋白過表達優先推薦IHC和ELISA檢測。而對于PD-L1表達的免疫組化檢測結果,目前上市的5種藥物都有其不同的評分標準和FDA推薦的診斷狀態,國內目前普遍采用的是針對Pembrolizumab的22C3抗體,通常作為伴隨診斷需計數腫瘤細胞的TPS,臨床中報告的截斷值以1%和50%為界。
              對于活檢穿刺標本的預處理也至關重要:腫瘤新鮮冷凍材料可提取出最高品質的DNA、RNA。在手術現場取樣時需要在顯微鏡下確認腫瘤細胞含量。必要時應采取富集腫瘤細胞的方法,如手工刮取或顯微切割法。選取以腫瘤細胞為主的、沒有明顯的壞死、黏液和炎性改變的組織進行檢測[1]。周圍炎癥嚴重的腫瘤、黏液產生過高的腫瘤、病變中心廣泛纖維化的腫瘤細胞不能采集,以免產生假陰性結果。切割后取其中一半,并利用另一半切面制作組織標本,然后進行確認。由于組織樣本通常需先進行病理學分析,在分析完成后應盡早將組織樣本置于穩定劑中,避免核酸降解[1-2]。對于需要轉送至院外的樣本,建議離體30分鐘后應先轉入中性福爾馬林或組織保存液中,低溫運輸至院外實驗室進行實驗操作。對于RNA檢測的樣本,如果未經穩定化處理則必須速凍后,放在干冰中運送。經過適當穩定化處理的樣本,可在常溫下運送。
              在檢測腫瘤基因突變時,不能一味追求檢測方法的靈敏度,靈敏度高的檢測方法對整個實驗過程中的質控要求更為嚴格,需防止因污染而產生假陽性。在腫瘤靶基因表達檢測時,由于腫瘤樣本的不可再生性,需謹慎選擇使用的方法,如選用熒光定量PCR要求提取的總RNA量達1µg以上,如果腫瘤組織過小,提取的RNA量可能達不到檢測要求,此時應考慮選用對樣本量要求低的檢測方法。DNA提取之前的病理質量控制非常重要,它決定了最終檢測結果的可靠性。
            參考文獻:
            [1]Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved GuidelineMM13-A
            [2]詹啟敏,曾益新,王鈺等,《腫瘤個體化治療檢測技術指南》(試行)

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