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            肺癌ALK基因融合的檢測相關問題
            編者按:間變性淋巴瘤激酶(ALK)是肺癌發生發展的重要驅動基因之一,也是目前非小細胞肺癌(NSCLC)治療的“黃金靶點”。ALK檢測結果的準確性對于臨床治療方案的選擇至關重要。本文針對肺癌ALK檢測中的一些問題如檢測的適用人群、ALK基因異常類型、ALK檢測方法及判讀標準以及檢測臨床實踐中相關注意事項進行了比較詳細的介紹。
              間變性淋巴瘤激酶(ALK)是肺癌發生發展的重要驅動基因之一,也是目前非小細胞肺癌(NSCLC)治療的“黃金靶點”。ALK基因融合在我國NSCLC中的發生率約5.6%,其中腺 癌的發生率為6.6%~9.6%。因此,準確鑒定出ALK融合的NSCLC,并給予精準靶向治療是提高患者生存的最佳手段。然而,由于ALK基因融合發生頻率較低且融合形式多樣,如何精準有效的檢測出ALK融合基因一直是困擾臨床醫生的難題。為此《中國非小細胞肺癌ALK檢測臨床實踐專家共識》、《非小細胞肺癌分子病理檢測臨床實踐指南》等共識及指南相繼出臺,為NSCLC中ALK的精準檢測以及治療提供了指導方案。
              ALK檢測的臨床意義
              ALK屬于受體型蛋白酪氨酸激酶(PTKs)家族,與腫瘤的發生密切相關,被認為是腫瘤的驅動基因。近年來ALK抑制劑的研發和臨床應用取得重大突破,伴有ALK基因融合的晚期NSCLC患者接受ALK抑制劑治療時,客觀緩解率和PFS顯著優于含鉑化療;而ALK陰性患者不能從ALK抑制劑中獲益。其次,對于初治ALK陽性晚期非小細胞肺癌患者,ALK抑制劑療效顯著優于傳統化療方案,同時ALK抑制劑相關不良反應較輕微,顯著改善了患者的生活質量。另外,伴有ALK基因融合的NSCLC手術患者與預后較差相關,無復發生存時間較短。研究表明,手術切除的NSCLC患者,ALK陽性比EGFR突變患者的RFS更短,提示ALK陽性患者術后應采取更積極的隨診計劃或進行輔助治療。
              ALK檢測的適用人群
              在我國,未經選擇的NSCLC中ALK陽性的病例約占5.6%,其中肺腺癌陽性率約6.6%~9.6%,且晚期患者陽性率高于早期患者。對于晚期肺腺癌患者,ALK基因檢測能夠有效篩選ALK抑制劑獲益人群;對于手術切除患者,ALK陽性患者的預后較差。因此,推薦經病理學診斷為肺浸潤性腺癌(包括含腺癌成分)的患者,不管其分期,均需進行ALK基因檢測。此外,ALK基因融合可在肺鱗狀細胞癌中檢出,我國肺鱗狀細胞癌中ALK基因融合發生率可達3.7%。有多個研究顯示肺鱗狀細胞癌中可出現EML4-ALK基因融合,且可在接受ALK抑制劑治療中獲益。因此推薦經活檢組織病理學診斷為非腺癌的晚期NSCLC患者可以進行ALK檢測,以期篩選出ALK陽性患者獲得更佳治療方案。
              ALK基因異常類型
              初治患者進行ALK基因檢測時,需檢測是否存在基因易位/融合/表達,可進行ALK融合變體亞型檢測及易位豐度檢測。目前至少發現了20多種EML4-ALK融合變體亞型,最常見的是EML4的變體1和變體 3v3a/b,所有的變體都保留了ALK的整個酪氨酸激酶結構域和EML4的N末端卷曲螺旋區域,這對于ALK的激活是必不可少的。ALK除最常見與EML4融合外,也可以與TFG、KLC1、SOCS5、H1P1、TPR、BIRC6等基因融合。研究結果顯示,不同的變異亞型可能與抗ALK治療的PFS時間相關,但由于研究人群以及藥物的差異性,不同研究結果存在差異,因此,這些復雜的ALK變異類型及其臨床意義尚待我們進一步研究。
              ALK檢測方法及判讀標準
              目前,我國批準了4個技術平臺的ALK基因檢測伴隨診斷試劑盒,包括ALK Ventana-D5F3 IHC、FISH、RT-PCR、NGS檢測平臺。研究結果顯示,這4個技術平臺檢測試劑均具有較高的靈敏度及特異性,均可用于ALK基因融合檢測。
              1.ALK IHC檢測目前有4種ALK抗體克隆,包括ALK1、5A4、D5F3 以及1A4。其中ALK Ventana-D5F3 IHC檢測方法是目前最快速、經濟的方法,其靈敏度及特異度高,且判讀標準簡單。因此建議使用ALK D5F3作為伴隨診斷檢測,而非Ventana D5F3的檢測僅用于ALK檢測結果初篩。其次,ALK Ventana D5F3 IHC結果判讀中存在一些陷阱,可能會出現假陽性或假陰性的情況,判讀時要注意以下幾點:(1)整體染色情況(間質背景是否干凈);(2)陽性信號位于胞質或者胞質和胞膜,細胞核不應著色;(3)染色是否相對均勻(ALK異質性少見),胞質內的著色也相對均勻;(4)注意腔緣效應以及黏液、壞死等導致的非特異性著色。另外對于非腺癌患者,在進行ALK Ventana-D5F3 IHC結果判讀時需要格外謹慎,必要時可加備注進一步說明或建議使用其他技術平臺進行驗證。
              2.FISH檢測 FISH檢測是ALK基因易位經典的檢測方法。但由于EML4-ALK易位是倒置易位,有些病例熒光分離信號距離較近,且斷裂點附近不穩定,會產生染色體崩塌導致距離更近,可造成假陰性判讀結果。另外,在試劑盒判讀標準中,ALK單綠信號(5′端熒光信號)是被判為陰性的,但有研究顯示,部分此類病例可出現ALK基因融合表達,且對ALK抑制劑治療有效。因此,對于FISH信號不典型或分離信號腫瘤細胞比例在臨界值附近的病例,判讀應謹慎,必要時加備注,并建議使用其他技術平臺進行復檢。
              3.RT-PCR檢測 基于RT-PCR檢測ALK融合基因表達方法的靈敏度和特異度均較強,但因為RT-PCR只能檢測已知ALK融合基因類型,所以存在假陰性可能。同時,因涉及基于mRNA的PCR擴增,其對于檢測環境和標本質量都有比較高的要求,因此應強化內、外部質控,避免污染。對于Ct值在閾值范圍附近的患者,在進行結果判讀時需要謹慎對待,需結合標本質量、腫瘤細胞含量、質控情況等綜合分析。
              4.NGS檢測  目前NGS在基因檢測中的地位越來越高,可以檢測點突變和基因易位,同時可以和其他基因一起檢測。一般情況下,ALK基因融合通過捕獲平臺在DNA水平或擴增子平臺在RNA水平上進行檢測?;诓东@平臺檢測結果的靈敏度和特異度均很高,而且能夠檢測到包括已知和未知位點在內的所有ALK易位,但是其準確性可能會受捕獲探針的覆蓋度、標本DNA質量,以及生物信息學分析等關鍵因素影響。NGS檢測流程復雜,影響因素繁多。在進行ALK結果判讀時,應充分掌握NGS檢測平臺及試劑的特點和局限性,并結合標本情況及測序數據等進行綜合判讀。
              ALK檢測臨床實踐中相關注意事項
              1. 多種樣本均可用于ALK基因融合檢測,首先推薦石蠟包埋的腫瘤組織樣本進行檢測,但手術樣本保存時間過長或未經過規范化前處理的標本可能影響檢測結果。晚期肺癌患者無法獲取腫瘤組織標本時,細胞學樣本經病理學評估腫瘤細胞量滿足需要時,推薦用于ALK檢測。對于少數晚期非小細胞肺癌患者無法獲得組織學或細胞學樣本的,可以嘗試使用血液/腦脊液進行ALK檢測。
              2.ALK IHC、FISH、RT-PCR、NGS各檢測平臺對腫瘤細胞含量均有一定的要求,如FISH檢測判讀標準要求至少判讀100個腫瘤細胞,而以PCR為基礎的RT-PCR技術和NGS技術,不僅需要一定的細胞量,同時需滿足一定的腫瘤細胞比例,只有滿足要求才能保證檢測結果的準確性。
              3.當存在IHC、FISH、RT-PCR、NGS檢測結果不一致時,臨床醫師應與檢測醫師或相關人員充分溝通,確保檢測結果均無異議時,才可進行ALK抑制劑的治療。
            參考文獻:
            1.中國非小細胞肺癌ALK檢測臨床實踐專家共識.中華病理學雜志,2019,48(12):913-920.
            2.非小細胞肺癌分子病理檢測臨床實踐指南(2021版).中華病理學雜志,2021,50(4):323-332.

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